Coloração de Gram o que é

A Microbiologia Clínica é sem dúvidas uma das principais áreas de atuação para profissionais de laboratório das mais diversas formações. Sua importância no cenário atual de pandemia em decorrência de um vírus – o coronavírus ou Sars-Cov 2 – é também inegável, destacando a importância desta área de atuação para a saúde e sobrevivência humana.

Índice Show

Técnica de Gram
Procedimento
Preparação para a coloração
Ilustrações:
Técnica de Gram
Hans Cristhian Joachim Gram
Soluções antimicrobianas:
O que é a coloração Gram?
Como funciona o método de Gram?
O que é Gram positivo e negativo?
Como a coloração de Gram é usada na prática laboratorial?

Segundo a Bióloga Doutora em Microbiologia e Professora da Pós-Graduação em Microbiologia Clínica do Instituto GPI (Teresina-Piauí), Drª Josie Haydée L. Ferreira Paranaguai, a pandemia reforçou a importância do olhar atento à microbiologia, que é uma ciência diretamente relacionada com as principais áreas da saúde e com uma alta relevância de saúde pública. Segundo a professora Drª Josie Haydée, as doenças infecciosas ainda possuem um grande impacto para a saúde pública no que se refere à mortalidade e morbidade, tendo a pandemia reforçado a necessidade de estudos acerca do controle biológico em todo o mundo.

Uma das principais metodologias utilizadas em laboratórios de microbiologia em todo o mundo é a bacterioscopia, que consiste na visualização direta das estruturas bacterianas através de microscopia óptica. Essa visualização é possível graças a utilização de corantes que evidenciam e classificam as bactérias de acordo com características estruturais, como por exemplo, a Coloração de Gram.

Desenvolvida em 1884, pelo pesquisador Hans Christian Joachim Gram, a técnica de coloração que leva seu nome consiste na utilização de uma sequência de corantes em uma lâmina contendo bactérias previamente fixadas. Essa coloração permite a diferenciação de bactérias de acordo com a presença (Gram positivas) ou ausência/escassez (Gram negativas) da camada de peptídeoglicanos sob a membrana plasmática da bactéria.

O passo a passo da coloração é simples e pode ser observado na imagem abaixo. Ao final do processo, será possível observar bactérias coradas em roxo (Gram Positivas) e róseas (Gram Negativas). Além de classificar as bactérias através da estrutura da parede de peptídeoglicanos, pode-se também levar em consideração aspectos morfológicos e organizacionais das estruturas observadas.

Sua importância para a microbiologia clínica é incontestável, haja vista que na maioria dos laboratórios a coloração de Gram é o primeiro passo na classificação e identificação de amostras bacteriológicas, oriundas de materiais biológicos diversos como escarro, pús ou outros fluidos orgânicos. Determinadas bactérias envolvidas em processos infecciosos podem ser prontamente identificadas e classificadas através da bacterioscopia permitindo uma intervenção médica que pode ser de extrema importância para o quadro clínico do paciente até que se obtenham resultados oriundos da cultura.

O profissional de saúde microbiologista deve estar sempre atento aos aspectos revelados na bacterioscopia, sendo essencial para a obtenção de resultados precisos e em tempo hábil, permitindo melhores condições de melhoria para os principais quadros

infecciosos.

Por Denilson de Araújo e Silva

Graduando em Biomedicina pelo Centro Universitário UNINOVAFAPI

Pós-Graduando em Microbiologia Clínica pelo Instituto GPI

Técnica de Gram

Provida Provendo Soluções Preservando Vidas. Eficiente Contra Bactérias, Vírus e Fungos. Prevenção deveria ser Obrigação!

A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactéricas que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas.

Provida Provendo Soluções Preservando Vidas. Eficiente Contra Bactérias, Vírus e Fungos. Prevenção deveria ser Obrigação!

Método.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

Procedimento

Confeccionar o esfregaço;
Corar com violeta de cristal por 60 segundos;
Lavar com esguicho de água destilada;
Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;
Lavar com esguicho de água destilada;
Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
Lavar com esguicho de água destilada;
Corar com safranina por 60 segundos
Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.

As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da seguinte forma.

O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactéria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano é maior em bactérias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e são coradas pelo vermelho de safranina.

A lavagem com álcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas. Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).

Preparação para a coloração

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzênicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes ácidos (são negativos, formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos, formando sais com ânions). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa, existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria, permitindo que esta fique corada. Para reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste, as estruturas celulares utilizam-se de mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias, sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque, além da substância corante, possuem água para permitir a dissociação iônica do corante; álcool para conservar e ácido fênico, que atua como mordente e como bacteriostático, evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante, aplica-se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:

O primeiro corante
O mordente
O diferenciador
Água (vai parar a diferenciação)
Segundo corante (vai ser contrastante)

Ilustrações:

Técnica de Gram

Hans Cristhian Joachim Gram

Bactéria

É fato comprovado. Infecção hospitalar mata, e muito, todos os anos. Boas práticas em higiene pessoal, limpeza de ambientes e utensílios utilizados para atendimento a clientes/pacientes são medidas preventivas eficientes, porém dentro de um processo contínuo, em que um grande número de pessoas são envolvidas e que também envolve equipamentos e acessórios médicos/hospitalares de áreas distintas, o risco de contaminação cruzada cresce de uma forma intensa, por que o volume de atendimentos são altos. Dessa forma os aditivos antimicrobianos ou antibacterianos incorporados em resinas plásticas, tecidos e tintas durante a fabricação, podendo ser um bem descartável ou durável mostram o seu valor de uso. Esses aditivos aliados às boas práticas ampliam a barreira de proteção quanto à contaminação cruzada, reduzindo a contaminação cruzada e consetuente infecção hospitalar , mas nunca abandonando as normas recomendadas de limpeza e procedimentos.

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Att.

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