Qual o limite de resolução do microscópio eletrônico de transmissão?

Por que um microscópio eletrônico de transmissão tem resolução muito maior que um microscópio óptico?

Ouça em voz altaPausarO microscópio é um tipo de equipamento de laboratório que permite visualizar as estruturas que não conseguimos ver a olho nu, no microscópio eletrônico o limite de resolução é muito maior que no microscópio óptico. Essa diferença se deve ao comprimento de onda da luz ou da energia.

Qual o limite de resolução do microscópio eletrônico?

Ouça em voz altaPausarMicroscópio eletrônico Enquanto o menor objeto observável pelo olho humano possui 100 micrômetros e o microscópio óptico possui um limite de quase 0,2 micrômetros de resolução, os microscópios eletrônicos atingem limite de resolução de 0,2 nanômetros.

Qual a diferença básica entre um microscópio óptico é um MEV?

Ouça em voz altaPausarA diferença básica entre o microscópio óptico e o eletrônico é que o eletrônico não utiliza a luz, mas sim feixes de elétrons. No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes eletromagnéticas.

Como é calculado o aumento final do microscópio?

Ouça em voz altaPausarPara calcular o aumento total de um microscópio teremos, pois, que multiplicar o aumento próprio da objetiva pelo aumento da ocular. Ocular: é uma lupa. As mais simples possui no seu interior duas lentes e um diafragma. ... As resoluções alcançadas e a maior parte da qualidade da imagem final dependem das lentes objetivas.

Qual o limite de resolução do microscópio?

• Limite da resolução X Número de abertura. O limite de resolução corresponde à menor distância entre dois pontos em que eles ainda podem ser distinguidos separadamente. Desse modo, O poder de resolução do microscópio corresponde aos menores limites de resolução possíveis. Assim, d = K x * N.A.

Qual é o bom microscópio?

• Portanto, um bom microscópio não é aquele que dá maior aumento e sim aquele que reproduz os detalhes do material observado. Não importa quantas vezes uma lente amplia, se ela não é capaz de fornecer uma imagem nítida do objeto observado. Dessa forma, um bom microscópio é sempre considerado em termos do seu poder de resolução.

Como funciona o microscópio de luz?

• Além dessas lentes, o microscópio possui uma parte mecânica (base, braço, revólver, platina, charriot, parafusos macro e micrométrico e parafuso de regulagem do condensador) e um sistema de iluminação (fonte luminosa, diafragmas, condensador e filtros). Os componentes básicos do microscópio de luz são mostrados na figura 1.1.

Quais os elementos de um microscópio óptico?

• Elementos de um microscópio óptico. 1-Ocular; 2-Revólver; 3-Objectiva; 4-Parafuso macrométrico; 5-Parafuso micrométrico; 6-Platina; 7-Espelho; 8-Condensador O microscópio é um instrumento óptico com capacidade de ampliar imagens de objetos muito pequenos graças ao seu poder de resolução.

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Microscopia �ptica

Conceitos B�sicos

Microscopia �ptica de Fluoresc�ncia

Conceitos B�sicos (01/02/2013)

Em um microsc�pio �ptico de luz composto, a radia��o atravessa a amostra (modo de transmiss�o) ou reflete (modo reflex�o) a superf�cie de uma amostra, sendo difratada, recolhida pela lente objetiva e formando uma imagem aumentada que chega aos olhos pela lente ocular ou que chega � uma CCD.
A lente condensadora � utilizada no modo transmiss�o e � respons�vel por focalizar a luz vinda de um iluminador.
A denomina��o composto refere-se ao fato de que o aumento final � uma composi��o dos aumentos da lente objetiva e da ocular (ou CCD). O aumento final � ent�o M = M(obj) x M(ocu). Dessa forma, se estamos usando uma lente objetiva de M(obj) = 100 X, e M(ocu) = 10 x, o aumento final � de M = 100 x 10 = 1000 x. No caso da CCD, geralmente M(ccd) = 12 x. Nesse caso, para a mesma objetiva, o aumento final seria de M = 1200x. O comprimento de onda da radia��o (luz vis�vel) � de cerca de 700 nm e � um dos fatores que define a resolu��o da t�cnica.
O poder de resolu��o do microsc�pio, considerando-se objetos pontuais, � definido por d = 0,61 λ/AN (Eq. 1), onde AN � a abertura num�rica da lente objetiva, d � a dist�ncia m�nima resolvida, em μm, e λ � o comprimento de onda da radia��o, tamb�m em μm.
A express�o � essa tamb�m (Eq. 1) no caso de microscopia de campo claro no modo transmiss�o se a abertura num�rica da lente condensadora for maior ou igual � abertura num�rica da lente objetiva, ou AN(cond) >= AN(obj). Exemplo: se uma objetiva de 10x tem AN(obj)=0,25 e a configura��o � tal que AN(cond) = 0,30, temos d = (0,61 x 0,7 μm)/0,25, d=1,71 μm. Mas se a abertura num�rica da lente condensadora for menor do que a abertura num�rica da lente objetiva, AN(cond) < AN(obj), � utilizada a express�o d = 0,61 λ/(AN(cond) + AN(obj) (Eq. 2). Como exemplo, se AN(obj) = 0,25 e AN(cond) = 0,20, temos d = (0,61 x 0,7 μm)/(0,20 + 0,25), d=0,95 μm. Nota-se que a resolu��o melhora quando AN (cond) < AN(obj), raz�o pela qual configuramos a lente consensadora (que possui AN vari�vel) como AN(cond) ~ 0,8 * AN(obj).
As equa��es 1 e 2 descrevem o crit�rio de Rayleigh para que dois pontos de difra��o espa�ados no plano de imagem sejam resolvidos. Pelo crit�rio de Rayleigh, dois objetos pontuais adjacentes s�o resolvidos quando o centro do disco de Airy (regi�o circular de difra��o de um ponto bem focalizado) de um ponto coincide com o primeiro m�nimo do disco de Airy de outro ponto no ponto de imagem (figura 1).

Figura 1

Microscopia �ptica de Fluoresc�ncia (18/06/2013)

Fotoluminesc�ncia � nome que se d� ao efeito de uma amostra absorver e re-erradiar luz. Se a luz � interrompida, mas a re-emiss�o persiste por alguns segundos, o efeito � chamado de fosforesc�ncia. A fluoresc�ncia ocorre quando a re-emiss�o ocorre apenas durante a absor��o da radia��o excitante. O intervalo de tempo entre os processos de absor��o e re-emiss�o � da ordem de um milion�simo de segundo. Quando uma mol�cula fluorescente absorve um f�ton de comprimento de onda adequado, um el�tron � excitado para um estado de energia mais alto e quase imediatamente volta ao seu estado inicial. Nesse processo, a mol�cula pode liberar a energia absorvida como um f�ton fluorescente. Como um pouco da energia absorvida � perdida no processo, o f�ton fluorescente emitido possui uma menor freq��ncia de vibra��o, ou seja, um comprimento de onda maior do que do f�ton inicialmente absorvido. Esse efeito forma a base da microscopia de fluoresc�ncia.

Atrav�s da Microscopia de �ptica de Fluoresc�ncia � poss�vel visualizar mol�culas espec�ficas que fluorescem na presen�a de radia��o excitante. A t�cnica pode ser usada para determinar a quantidade, distribui��o e din�mica de macromol�culas espec�ficas em c�lulas, possibilitando o estudo de diversos mecanismos celulares.

Geralmente, as amostras n�o s�o auto-fluorescentes e o uso de corantes chamados fluor�foros (ou fluorocromos) � necess�rio para torn�-las fluorescentes. Os fluor�foros s�o mol�culas que absorvem f�tons com energia de determinado espectro de excita��o e re-emitem f�tons com energia em determinado espectro de emiss�o (ou de fluoresc�ncia). Os espectros de excita��o e de emiss�o possuem um pico de intensidade. A diferen�a em nanometros entre os picos do espectro de excita��o e do espectro de emiss�o � chamado de desvio de Stokes. Quanto maior o desvio de Stokes, mais vantajoso � o corante, pois as bandas de excita��o e fluoresc�ncia s�o mais f�ceis de serem isoladas usando filtros de interfer�ncia. Para o fluor�foro DAPI, por exemplo, o comprimento de onda de absor��o referente ao pico de intensidade � de 345 nm, enquanto que o pico de emiss�o fluorescente ocorre para comprimento de onda de 460 nm, o que d� uma diferen�a de 115nm (desvio de Stokes). Outra caracter�stica importante de um fluor�foro � a efici�ncia qu�ntica de emiss�o de fluoresc�ncia, que � a raz�o entre f�tons fluorescentes emitidos e f�tons absorvidos. O coeficiente de extin��o molar descreve a capacidade do corante em absorver um f�ton e � dado em unidades de absorb�ncia para o comprimento de onda referente ao m�ximo de intensidade. Outras caracter�sticas relevantes dos fluor�foros s�o sua resist�ncia � fotodegrada��o, sua solubilidade em meio aquoso e sua estabilidade qu�mica. Mais de um fluor�foro pode ser utilizado ao mesmo tempo em uma amostra, registrando diferentes estruturas ou processos da amostra. Existem algumas subt�ncias naturalmente fluorescentes em produtos comuns, tais como extrato de espinafre (vermelho), extrato de cenoura (amarelo), leite em p� (azul) e margarina (azul).

O microsc�pio de fluoresc�ncia possui uma s�rie de modifica��es importantes para se obter imagens brilhantes e bem definidas. Eles possuem filtros especiais e m�todo �nico de ilumina��o para a produ��o de imagens. Para imagem eficiente de alto contraste, a ilumina��o e a objetiva s�o posicionadas do mesmo lado da amostra. Assim, as lentes objetivas funcionam tanto como lentes consensadoras, entregam a radia��o excitante, quanto coletando a luz fluorescente emitida pela amostra. Os filtros s�o projetados para isolar e manipular dois conjuntos distintos de comprimentos de onda, os de excita��o e os de fluoresc�ncia (ou emiss�o). A banda de comprimentos de onda de excita��o (que s�o curtos) vinda do iluminador e filtros � direcionada para a amostra, enquanto que a banda de comprimentos de onda longos de fluoresc�ncia emitida pela amostra forma a sua imagem. S�o usadas objetivas de alta abertura num�rica para maximizar a coleta de luz e fornecer a melhor resolu��o e contraste poss�veis.

Uma fonte de luz brilhante como uma l�mpada de arco de xenon ou de merc�rio, chamada de epi-iluminador, � necess�ria j� que uma banda fina de comprimentos de onda curtos � usada para excitar os fluor�foros. A ilumina��o consiste de uma l�mpada, lentes coletoras, outras lentes e filtros. Quanto � l�mpada, 100 W de merc�rio ou 75 W de xenon s�o geralmente usadas. Ambas as l�mpadas fornecem a banda entre 400-700 nm, mas a l�mpada de merc�rio, conhecidamente, possui linhas de emiss�o bem definidas em 366 (UV), 405, 436, 546 e 578 nm. Essas linhas s�o �teis para excitar certos fluor�foros, como DAPI, por exemplo. Em 546 nm, essas l�mpadas s�o de 10 a 100 x mais brilhantes do que a l�mpada de 100W halog�nea, comumente utilizada em microscopia de campo claro e essa vantagem � necess�ria para a Microscopia de Fluoresc�ncia.

Conjuntos de filtros fluorescentes contendo tr�s filtros essenciais (filtro de excita��o, espelho dicr�ico e filtro de barreira, para emiss�o) s�o montados na forma de um cubo no caminho �ptico entre o epi-iluminador e a objetiva (veja figura 2). O filtro de excita��o seletivamente transmite uma banda de comprimentos de onda curtos para excitar o fluor�foro na amostra. O espelho dicr�ico reflete a luz de comprimento de onda curto em dire��o �s lentes objetivas e amostra, mas transmite a luz fluorescente de comprimento de onda longo em dire��o ao detector. O filtro de barreira transmite a banda de comprimentos de onda fluorescentes, mas bloqueia qualquer comprimento de onda curto de excita��o residual. Os comprimentos de onda fluorescentes formam ent�o a imagem no olho ou na c�mera.

Figura 2 - Cubo de Filtros

Para realizar imagens de fluoresc�ncia deve-se saber selecionar corretamente o(s) fluor�foro(s), os filtros e ilumina��o adequada, al�m de avaliar corretamente a qualidade dos sinais de fluoresc�ncia. Deve-se tamb�m tentar evitar a fotodegrada��o, interrompendo a ilumina��o para a amostra nos momentos em que ela n�o est� sendo observada.
A seguir uma imagem de leite em p� visto em Microscopia de Fluoresc�ncia utilizando-se cubo para DAPI (filtro de excita��o de 330 nm - 385 nm e filtro de emiss�o de 420 nm)

Figura 3 - Imagem de leite em p� visto em Microscopia de Fluoresc�ncia

Refer�ncias
- http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html
- Douglas B. Murphy. "Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging". John Wiley & Sons. (2001).

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Fernanda S Teixeira

Qual é o limite de resolução do microscópio?

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